Robert Mario De Niro Jr., 17 Ağustos 1943 yılında New York'ta doğdu. Sanatçı bir ailenin çocuğu olmanın avantajını daha küçük yaşlarda hissetmiştir. Annesi Virginia Admiral, bir ressamdı, babası Robert da şair, ressam ve heykeltıraş. Doğup büydüğü semtte ağırlıklı olan İtalyan komşuları bu içe kapanık çocuğu 'Bobby Milk' diye çağırırlardı. Utangaç bir çocuk olduğu doğruydu; zamanının çoğunu kitaplar arasında geçiriyordu. Broadway’de sahnelenen oyunlarla büyüyen De Niro, ilk kulis havasını Oz Büyücüsü rolüyle kokladı.
İlk filmi 1963’te tamamlanan, ancak 1969’da gösterime giren The Wedding Party'dir. Ardından Hi, Mom!, Bloody Mama, Jennifer on My Mind, Born to Win ve The Gang That Couldn’t Shoot Straight gibi küçük bütçeli filmlerde yer aldı. 1973'te De Niro ve yönetmen Martin Scorsese birlikte filmler çevirmek üzere adım attılar. İlk filmleri Mean Streets, sonraki yıllarda gelecek sekiz filmin habercisi oldu. 1976’da Taxi Driver ve 1977’de New York, New Yorkta birlikte çalışan De Niro ve Scorsese, artık ikili olarak anılır oldu. Ardından Kızgın Boğa / Raging Bull (1980), The King of Comedy (1983), Sıkı Dostlar / Goodfellas (1990), Korku Burnu (1991) ve Casino (1995) gelir.