Lily Gladstone, 2 Ağustos 1986’da Montana’da dünyaya geldi. Beş yaşındayken Return of the Jedi filmini izledikten sonra bir Ewok'u canlandırma arzusu onu henüz çocuk yaşında oyunculuk kariyerine yönlendirdi. Genç yaşında Missoula Çocuk Tiyatrosu'nda Cinderella oyununda, kötü üvey kız kardeş rolünü üstlendi. Seattle’da gençlere yönelik kurulan bir eğitim tiyatrosu olan Stone Soup Theatre'a kaydoldu ve öğrenci filmlerde rol aldı. 2004 yılında Washington'daki Mountlake Terrace Lisesi'nden mezun oldu. 2008’de ise Montana Üniversitesi Oyunculuk/Yönetmenlik Bölümü'nden BFA derecesi ve yan dal çalışmaları ile mezun oldu. Montana Üniversitesi'nde okurken de tiyatro ile ilgilenen Lily Gladstone, Riders to the Sea (2006), Richard III (2006), Miss Julie (2007) ve Coyote on a Fence (2008) oyunlarında rol aldı. Mezun olduktan sonra oyunculuk dersleri ve atölye çalışmaları verdi. Lily Gladstone sinemaya geçişi ise “Jimmy P: Psychotherapy of a Plains Indian” (2012) adlı yapım ile oldu. Daha sonra Kelly Reichardt’ın yönettiği Certain Women (2016) ve First Cow (2019) filmlerinde rol aldı. Certain Women’daki performansıyla eleştirmenlerin beğenisini kazandı ve Independent Spirit Ödülü’ne aday gösterildi. Gladstone, 2023 yılında Martin Scorsese’nin yönettiği Killers of the Flower Moon filminde Mollie Kyle rolünü oynamıştır. Bu rol, onun kariyerinde bir dönüm noktası olmuştur. Mollie Kyle, Osage kabilesinden bir kadındır ve 1920’lerde Oklahoma’da yaşanan cinayetlerin kurbanlarından biridir. Gladstone, bu rolüyle Altın Küre Ödülü’nü En İyi Kadın Oyuncu kategorisinde kazanmıştır. Altın Küre Ödülü kazanan ‘ilk yerli’ (Indigenous) aktris olmuştur. Gladstone, ayrıca televizyon dizilerinde de yer almıştır. Room 104, Billions ve Reservation Dogs gibi dizilerde konuk oyuncu olarak oynamıştır.