Jensen Ross Ackles, 1 Mart 1978'de Dallas, Texas'ta doğdu. Annesi Donna Joan bir ev hanımı, babası Alan Roger Ackles ise bir aktördü. Richardson'da büyüyen Ackles, Lloyd V. Berkner Lisesi'ne devam etti ve 1996 yılında mezun olduktan sonra oyunculuk kariyerine başlamak için Los Angeles'a taşındı. 

Jensen Ackles, dört yaşından itibaren ara sıra modellik yaptıktan sonra 1996 yılında oyunculuğa yoğunlaşmaya başladı. NBC'nin popüler pembe dizisi "Days of Our Lives"da Eric Brady rolüyle dikkat çekti ve bu rolüyle birçok Daytime Emmy Ödülü'ne aday gösterildi. 2000 yılında "Days of Our Lives" dizisinden ayrıldıktan sonra, Marilyn Monroe'nun hayatını anlatan mini dizi "Blonde"da yer aldı. Daha sonra "Dark Angel" dizisinde seri katil Ben/X5-493 ve onun klonu Alec/X5-494 karakterlerini canlandırdı. Ackles, 2005 yılında "Supernatural" dizisinde Dean Winchester rolüyle büyük bir çıkış yaptı. Kardeşi Sam (Jared Padalecki) ile birlikte ABD'yi dolaşıp doğaüstü yaratıklarla savaşan Dean rolüyle 15 sezon boyunca ekranlarda kaldı ve dizi, Kuzey Amerika'nın en uzun soluklu bilim kurgu dizisi oldu. Bu dönemde ayrıca "My Bloody Valentine 3D" (2009) filminde başrol oynadı ve "Batman: Under the Red Hood" (2010) gibi animasyon filminde Jason Todd karakterini seslendirdi. Ackles, 2020 yılında Amazon Prime Video'nun popüler dizisi "The Boys"un üçüncü sezonunda Soldier Boy karakterini canlandırmak üzere kadroya katıldı. Aynı zamanda eşiyle birlikte Chaos Machine Productions adlı yapım şirketini kurarak Warner Bros. Television ile anlaşma yaptı. 2022'de "The Winchesters" adlı "Supernatural" prequel dizisinde anlatıcı olarak yer aldı. Ayrıca, 2022 yılında ABC'nin "Big Sky" dizisinin ikinci sezon finalinde şerif Beau Arlen olarak konuk oyuncu oldu ve bu rol ile üçüncü sezonda kadroya dahil oldu.